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自20世紀(jì)40年代起，人們都采用兔眼Draize試驗評判化妝品原料及其成品的眼刺激。但動物試驗在化妝品企業(yè)中開展難度、成本等相對較高，因此動物替代方法成為了企業(yè)內(nèi)部的首選。

測試類型可分為四類，包括細(xì)胞（如3T3成纖維細(xì)胞，人原代角質(zhì)形成細(xì)胞等）、離體器官（如牛角膜、豬角膜、兔眼球、雞眼球等）、類器官（如雞胚等）、人工組織方法（如重建角膜Epiocular、3D表皮模型等）。其中絨毛尿囊膜（chorioallantoic membrane，CAM）取樣方便、容易，中胚層富含的血管網(wǎng)絡(luò)很好地模擬了眼結(jié)膜結(jié)構(gòu)，因此，是眼刺激性試驗替代方法中廣泛使用的模型之一。

目前使用CAM用于眼刺激測試的方法有三種：雞胚絨毛尿囊膜試驗（Hen’s egg test on the chorioallantoic membrane,HET-CAM）,雞胚絨毛尿囊膜血管試驗（Chorioallantoic membrane vascular assay, CAMVA）,雞胚尿囊膜臺盼藍(lán)染色試驗(the chorioallantoic membrane-trypan blue staining assay, TBS-CAM)。本文將針對以上三種動物替代試驗展開介紹。

1. 雞胚絨毛尿囊膜試驗（HET-CAM）

HET-CAM最早于1985年由Luepke建立，隨后國內(nèi)外對于HET-CAM的研究及應(yīng)用比較廣泛，2009年中國質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局對于HET-CAM發(fā)布了檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN／T2329-2009，規(guī)范了HET-CAM的操作及評判標(biāo)準(zhǔn)。由于化學(xué)物對CAM的刺激反應(yīng)多種多樣，因此HET-CAM以出血、血管溶解、凝血作為觀察終點，即在雞胚發(fā)育第9天時神經(jīng)組織和痛感還沒形成的階段，檢測受試物導(dǎo)致CAM產(chǎn)生三種反應(yīng)的嚴(yán)重程度。針對不同狀態(tài)及劑型的化妝品或原料有不同的評價方法，對于透明液體受試物應(yīng)采用反應(yīng)時間法，記錄反應(yīng)過程中出現(xiàn)三種反應(yīng)的時間點，從而計算樣品的刺激性。對于膏體或混濁液體則采用終點評價法，在反應(yīng)終點時對反應(yīng)現(xiàn)象進(jìn)行評價。反應(yīng)時間法更強(qiáng)調(diào)的是血管效應(yīng)出現(xiàn)的時間快慢，與樣品最終造成的血管效應(yīng)嚴(yán)重程度無關(guān)。終點評價法則更強(qiáng)調(diào)的是最終產(chǎn)生的的嚴(yán)重程度，過程中對血管效應(yīng)產(chǎn)生的快慢無關(guān)。雖然在標(biāo)準(zhǔn)中記載的兩種方法是針對不同劑型的方法處理，但建議篩選和比對配方、原料時，最好是采用同一種處理方法進(jìn)行測試，對比性和參考性更強(qiáng)。

研究發(fā)現(xiàn)，HET-CAM可較好地檢測表面活性劑以及以表面活性劑為基礎(chǔ)的產(chǎn)品的刺激性，對于一些能對CAM進(jìn)行著色的物質(zhì)，HET-CAM不適用，且實驗存在一定的主觀性，實驗員在操作時，應(yīng)對血管現(xiàn)象了解、熟悉，避免出現(xiàn)誤判。

2. 雞胚尿囊膜臺盼藍(lán)染色試驗(TBS-CAM)

在HET-CAM的基礎(chǔ)上通過添加臺盼藍(lán)染色進(jìn)行改進(jìn)，可克服HET-CAM實驗主觀性強(qiáng)和損傷難量化的缺點。

臺盼藍(lán)是一種廣泛用于區(qū)分存活細(xì)胞與死亡細(xì)胞的染料，常用于檢測細(xì)胞膜的完整性和細(xì)胞的存活率。喪失活性或細(xì)胞膜不完整的細(xì)胞可被臺盼藍(lán)染成藍(lán)色而正常的活細(xì)胞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥臺盼藍(lán)，細(xì)胞不會被染成藍(lán)色。TBS-CAM正是利用臺盼藍(lán)的這個特點，通過受試物與CAM接觸后，損傷的CAM會吸收加入的臺盼藍(lán)，一定時間后剪下CAM，沖洗、干燥并稱重，萃取后測量其萃取液吸光度值，通過計算單位膜重量吸收的臺盼藍(lán)的量（ISTB）作為檢測終點，以此用來評判受試物的刺激性。TBS-CAM不受劑型的束縛，即染色原料或化妝品不影響檢測結(jié)果的觀察，解決了HET-CAM不能用于染色物質(zhì)的測試的難題，亦能對損傷程度進(jìn)行量化，減少人為地對刺激性進(jìn)行評分，客觀地對刺激進(jìn)行評價。

3. 雞胚絨毛尿囊膜血管試驗（CAMVA）

CAMVA采用的是孵化至第10天的雞胚，將化妝品原液或特定濃度下的化妝品原料滴加于聚四氟乙烯樹脂環(huán)內(nèi)，培養(yǎng)30min后觀察環(huán)內(nèi)血管效應(yīng)-鬼影血管、充血以及不同程度出血并予以評分，最終計算其算術(shù)平均值即得到NC值。NC值則可以評判物質(zhì)在某個特定濃度下的刺激性。CAMVA適用于評價化妝品或一定濃度下的原料的刺激性，與使用濃度相關(guān)，可測得不同濃度下物質(zhì)的刺激性。與HET-CAM的終點評價法的共同點則是在于，CAMVA更強(qiáng)調(diào)的是通過樣品致CAM最終的損傷嚴(yán)重程度進(jìn)行評價。

綜上所述，三種試驗各有其優(yōu)缺點（見表1），各在不同維度對刺激性進(jìn)行評價，在化妝品配方及原料篩選時，可選用一種或者組合的形式對其進(jìn)行評價，如HET-CAM與TBS-CAM試驗的結(jié)合，可從血管效應(yīng)產(chǎn)生的快慢以及對實驗損傷程度的量化兩個維度對受試物進(jìn)行評價，也結(jié)合了主觀與客觀的評價，減少誤差。

表1

這類試驗材料方便易得，操作相對簡單易行，設(shè)備及耗材成本相對較低，結(jié)果易于觀察，在日化企業(yè)中搭建可行性較強(qiáng)。早期被美國機(jī)構(gòu)替代方法管理小組，歐洲委員會，英國內(nèi)務(wù)府，歐洲化妝品、盥洗用品和香水協(xié)會及日本、德國等廣泛研究與評價。

在中國，這方面的研究也有一定的進(jìn)展，報道顯示此方法是比較有前途的替代方法。隨著化妝品行業(yè)及消費者的安全性意識的提高，以及替代試驗的研究及技術(shù)的越來越成熟，包括基于CAM開展的試驗方法應(yīng)用越來越廣泛。

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